凝集素在組織化學、ELISA 和蛋白質印跡中的應用

組織化學:

1。石蠟切片染色程序:用二甲苯或其他清洗劑和分級酒精系列對組織切片進行脫蠟和水化，在自來水中沖洗5分鐘。如果需要，檢索抗原使用抗原揭膜溶液(檸檬酸鹽為基礎，Cat。不。H-3300或tris型，Cat。不。h - 3301)。1 b。冷凍切片染色程序:風干切片。染色前立即用丙酮固定切片。將片傳輸到緩沖區。如果內源性酶活性存在，用適當的方法滅活。

2. 如果需要，使用鏈親和素/生物素阻斷試劑盒(Cat)進行鏈親和素/生物素阻斷。不。sp - 2002)。Avidin/Biotin阻斷試劑盒(Cat.;不。SP-2001)是一種含有末端甘露糖殘基的糖蛋白。不建議使用親和素/生物素阻斷試劑盒，特別是當使用甘露糖特異性凝集素時。

3.用carbofree™阻斷溶液(Cat)孵育片段阻斷非特異性結合。不。SP-5040)在室溫下放置30分鐘。從切片上吸去多余的堵塞溶液。

4. 在PBS (10 mM磷酸鈉，150 mM NaCl, pH 7.4)中加入約2-20 μg/ml的生物素化凝集素，在室溫下孵育30分鐘。用TPBS (PBS + 0.05% Tween®20)清洗。

5. 準備VECTASTAIN®Elite®ABC-HRP (Cat)。不。PK-6100)或VECTASTAIN®ABC-AP (Cat;不。根據試劑盒說明使用AK-5000)試劑。涂于切片上，室溫孵育30分鐘。用TPBS清洗。6. 為步驟5中使用的酶系統應用適當的沉淀底物。對于過氧化物酶，impact®DAB (Cat。不。SK-4105);用于堿性磷酸酶，impact®Vector®Red (Cat;不。推薦使用SK-5105)。用自來水沖洗。7. 防污(可選)，清潔和安裝。

ELISA:

1。將50-200 μl約3 μg/ml的糖蛋白溶液放入所需孔中，將目標蛋白吸附到微滴板上。有些井可能不進行處理，作為負控制。37℃孵育1小時。用TPBS (PBS + 0.05% Tween 20)洗滌孔3次。

2. 阻斷非特異性結合，在室溫下用無碳水化合物阻斷溶液將每個孔填滿30分鐘。用TPBS洗三次井。在下面的程序中，試劑的體積為100 cm2膜的開發進行了優化。體積可以按比例調整不同大小的印跡。

3.在PBS中加入50-200 μl約2-20 μg/ml的生物素化凝集素，室溫孵育30分鐘。用TPBS洗三次井。

4. 根據試劑盒說明制備veectastain Elite ABC-HRP或veectastain ABC-AP試劑。涂于孔中，室溫孵育30分鐘。用TPBS洗三次井。

5. 為步驟4中使用的酶系統應用適當的非沉淀底物。對于過氧化物酶，TMB (Cat。不。推薦使用SK-4400)。6. 用分光光度法定量有色反應產物。

Western Blot:

1。根據標準程序進行電泳并將蛋白質轉移到膜上。

2. 室溫下，在無碳水化合物阻斷溶液中培養30分鐘，阻斷非特異性結合。使用足夠的體積來覆蓋薄膜。

3.在含有約2-20 μg/ml生物素化凝集素的PBS中室溫孵育膜30分鐘。用TPBS (PBS + 0.05% Tween 20)洗滌。

4. 根據試劑盒說明制備veectastain Elite ABC-HRP或veectastain ABC-AP試劑。室溫下將膜在試劑中孵育30分鐘。用TPBS清洗。

5. 為步驟4中使用的酶系統應用適當的底物。對于過氧化物酶，DuoLuX®化學發光和熒光底物(過氧化物酶，Cat。不。SK-6604)或impact®DAB (Cat。不。sk - 4105)建議;堿性磷酸酶，化學發光和熒光底物(堿性磷酸酶，Cat。不。SK-6605)或BCIP/NBT(堿性磷酸酶，Cat。不。SK-5400)。僅供研究使用。不適用于動物或人類的治療或診斷用途。

負控制:負控制應該在上述每種方法中并行運行，以驗證綁定結果。當應用凝集素時，最合適的陰性對照之一是預先吸收凝集素與已知凝集素具有高親和力的特定糖的濃度。Vector Laboratories提供了一系列用于這一目的的糖。將凝集素在含有約200 - 500mm糖的溶液中稀釋到合適的工作濃度。該混合物在室溫下結合30至60分鐘。在吸收孵育之后，將混合物替換為未吸收的凝集素，并在相同條件下孵育。測試方法遵循后續檢測程序。在大多數情況下，絕大多數凝集素結合到組織切片(膜印跡等)將被消除。在這些條件下，一些與切片的痕量結合(印跡等)可能仍然存在，并且可能表明存在二級或三級糖偏好。這些陰性對照結果應與試驗結果進行比較，以確定結合的特異性。