雙染法免疫熒光組織化學染色步驟

如果同一標本中需要同時顯示A、B兩種抗原，則A抗原的抗體用FITC標記，B抗原的抗體用TRITC標記，可采用以下染色方法用過的：

免疫熒光細胞化學雙染

原代培養的大鼠端腦細胞第14天胚胎：在成骨形態蛋白的誘導下，乙酰膽堿轉移酶（綠色熒光）和同源結構域蛋白Islet-1（紅色熒光）共存于細胞質中（激光掃描共存）。聚焦顯微鏡觀察）

1.一步雙染法，將兩種熒光標記抗體按適當比例（A+B）混合，按照直接法進行染色。

2.兩步雙染法，先用TRITC標記的抗體A進行免疫熒光染色，然后用FITC標記的抗體B進行免疫熒光染色。根據兩種抗體的動物種類，可以采用直接法或間接法。結果是A抗原呈橙紅色熒光，而B抗原呈黃綠色熒光。在應用中，常用的方法是免疫熒光組織化學中的間接法與熒光染料SABC-Cy3法的結合。例如，在實驗設計中，選擇小鼠抗大鼠A和兔抗大鼠B作為兩種不同的特異性一抗，匹配的二抗分別為FITC-抗小鼠IgG和生物素化抗兔。免疫球蛋白G。

進行雙染時，由于兩種一抗來源不同，可能會混合一抗。孵育后，清洗未結合的一抗。滴加二抗時，先加入人生物素化抗兔IgG（二抗）孵育。清洗后，滴下 SABC-Cy3 復合物。特異性熒光，然后與FITC-抗小鼠IgG（二抗）孵育，最后封片觀察。結果，A抗原顯示綠色熒光，B抗原顯示紅色熒光。

該方法中需要注意的是，兩種一抗混合稀釋時，抗體的終濃度應為每種抗體的工作濃度。也就是說，混合液要同時滿足兩種一抗的工作濃度。如果兩個一抗來自同一物種，則必須進行兩次雙染，即A抗原先用第一個一抗和第一個熒光二抗染色，然后用第二個一抗和第一個熒光二抗洗滌熒光二抗。 B抗原染色需使用兩種熒光二抗，否則會發生交叉反應，導致染色不特異。