小分子藥物聚乙二醇化方法

聚乙二醇(PEG)是乙二醇的聚合物，相對分子質量為200～8000或以上。由重復的乙氧基組成，不僅具有良好的水溶性，而且易溶于苯、乙腈、乙醇等有機溶劑。 PEG分子的特點如下：

①低分散性：相對分子質量（Mr）小于5000的分散性為1.01，分子量（Mr）大于5000的分散性為1.1，具有較寬的范圍。分布和更大的選擇性；
②兩親性：既溶于有機溶劑又溶于水；
③無毒：研究表明大于1000的聚乙二醇無毒，已用于各種食品、化妝品和藥品中；
④ 可生物降解：聚乙二醇在體內直接消除，結構不發生任何變化。分子量小于20000的代謝物可以通過腎臟代謝，較大分子可以通過消化系統代謝。

聚乙二醇化藥物的特點

大多數蛋白質藥物、多肽藥物、化學藥物都伴有一些自身無法克服的問題，如作用時間短、免疫原性大、副作用大等。 PEG呈中性、無毒，具有很好的理化性質和良好的生物相容性，是美國FDA批準用于體內注射藥物的少數化學品之一。因此，通過化學方法將活化的聚乙二醇與蛋白質、肽、小分子藥物和脂質體連接，即對藥物分子進行聚乙二醇化，可以有效提高藥物分子的生物半衰期，降低其毒副作用。可以減少影響。其中，研究最多的是蛋白質的PEG修飾。與未修飾的蛋白質藥物相比，聚乙二醇化的蛋白質藥物具有以下優點：

（1）生物活性更強；
（2）脂質體對腫瘤有更強的被動靶向作用；
(3)較長的半衰期；
(4)降低最大血藥濃度；
(5)血藥濃度輕微波動；
(6)酶促降解少；
(7)免疫原性和抗原性較低；
(8)毒性較小；
(9) 溶解性更好；
(10)減少用藥次數；
(11)提高患者依從性，改善生活質量，降低治療費用。

聚乙二醇化方法

鑒于聚乙二醇化對藥物性質的巨大影響，聚乙二醇化已成為藥物開發和提高已上市藥物療效的重要途徑。因此，如何進行PEG化就成為重中之重。

首先，需要選擇合適的PEG進行分子修飾。修飾劑的選擇主要考慮以下5個方面：

（1）選擇PEG相對分子質量（Mr）的確定應同時考慮生物活性和藥代動力學因素。應用太大的聚乙二醇化蛋白藥物會導致藥物失去大部分生物活性。當使用低Mr（<20000）聚乙二醇化蛋白質藥物時，修飾后的蛋白質藥物與原型藥物相比，生物活性和藥代動力學性質沒有本質變化。因此，一般選擇40000-60000范圍內的PEG作為修飾。
(2)修飾位點的選擇應基于對蛋白質構效關系的分析。選擇不與受體結合的蛋白質表面殘基作為修飾位點，使得修飾后的蛋白質能夠保留較高的生物活性。常見的修飾位點有氨基修飾、羧基修飾和硫醇修飾；
(3) PEG修飾劑與氨基酸反應的特異性取決于修飾劑的化學性質和修飾位點的選擇。
(4)PEG修飾劑的水解穩定性和反應活性取決于活化基團的穩定性和修飾反應條件尤其是pH值的控制。一般來說，PEG修飾劑反應活性高，因此穩定性較差，容易水解；
(5)聚乙二醇化蛋白的活性、毒性和抗原性與聚乙二醇修飾的大小和類型有關。一般情況下，隨著PEG相對分子量的增加，蛋白質活性的損失逐漸增加。此外，不同的PEG修飾劑對蛋白質生物活性的影響也不同。

其次，激活PEG。聚乙二醇化蛋白質主要是通過PEG末端羥基與蛋白質氨基酸殘基反應實現的。 PEG末端羥基活性較差，必須用活化劑活化才能在體內溫和條件下共價修飾蛋白質。常見的PEG活化方法有：

(1)羰基二咪唑法：該方法首先用于多肽的合成，并已被證明是形成酰胺鍵的良好試劑。

(2)N-羥基琥珀酰亞胺法： (a)活化N，N-琥珀酰亞胺碳酸酯。該反應需要在無水條件下進行。 (B) 活化琥珀酸酐和N-羥基琥珀酰亞胺。該方法得到的聚乙二醇具有較高的活性。最好在非水環境中進行蛋白質偶聯。

N,N-琥珀酰亞胺碳酸酯活化的 PEG


琥珀酸酐和 N-羥基琥珀酰亞胺活化的 PEG

(3)氰尿酰氯法：氰尿酰氯又稱三氯嗪(TST)，是一種對稱雜環化合物。 David 使用 TST 與聚乙二醇上的羥基發生反應。只有一個氯原子被取代，其他氯原子與蛋白質氨基反應。

(4)光氣活化法：Kurfuerst提到了由N-羥基琥珀酰亞胺鉀鹽、硝基苯酚、三氯苯酚與光氣反應制備活化聚乙二醇的方法。激活分為兩個步驟，如下圖所示。

(5)聚乙二醇對蛋白質半胱氨酸殘基進行化學修飾。磺基特異性修飾的常見PEG活化方法如下圖所示。

(6)連接酶位點的聚乙二醇：除了傳統的化學修飾方法外，還可以通過酶催化等其他方式實現修飾，以G-TGase為例。

最后選擇合適的蛋白質氨基酸殘基位點或小分子藥物位點進行位點特異性修飾。用活化的PEG對合適的蛋白質氨基酸殘基進行位點特異性修飾可以提高天然蛋白質的功效。蛋白質藥物PEG修飾技術最大的問題是無法實現位點特異性修飾，修飾產物不均一，給分離純化帶來很大困難，也極大阻礙了臨床應用。根據蛋白質的氨基酸性質和PEG衍生物的特點，科學家在使用PEG進行修飾時，選擇不與受體結合的蛋白質表面殘基作為修飾位點。這樣，修飾后的蛋白質藥物除了具有聚乙二醇化帶來的優異性能外，還具有較高的生物活性。目前上市藥物中常見的修飾位點包括氨基、羧基、磺基、二硫基、糖基以及非極性氨基酸的一些特定位置。