什么是染料聚集Farbstoff-Aggregation？

通過吸收光，染料分子進入電子激發態。吸收的能量僅存儲很短的時間，并在激發態壽命結束后再次發射，例如作為熒光。

在染料溶液中，被激發的染料分子（被視為點偶極子或振蕩器）如果它們之間的距離足夠大，則不會相互影響。因此，整體中存在的發色團的吸收和熒光不會改變。

發色團之間的平均距離約為 5 - 10 nm，影響僅通過振蕩器的“輻射場"發生，即沒有直接接觸。例如，通過福斯特共振能量轉移（FRET）模型描述了兩種染料分子之間的這種類型的相互作用。

如果發色團之間的距離變得更小，例如在非常濃縮的溶液中，則由于各個振蕩器的靜電力，可能會產生強烈的相互影響。由于單個染料分子的分子間相互作用，這種染料溶液的吸收和熒光行為都會發生顯著變化。

羅丹明 6G 水溶液
在羅丹明6G濃水溶液的紫外/可見光譜中，在主吸收帶的短波邊緣可以觀察到肩峰的出現。如果通過稀釋溶液來改變濃度（c），并以同樣的方式增加比色皿的層厚度（d），那么根據朗伯-比爾定律，人們總是可以預期相同的消光，則以下過程是觀察到：等吸光點的出現。

- 所有相關物質的濃度變化是線性的，dE/dc = 0 - 表明兩種（或更多）物質以一種確定的方式相互轉化或彼此處于平衡狀態。所以這是一個動態平衡。



解離或二聚常數可以通過實驗確定：在稀釋系列中，溶液的稀釋始終通過層厚度的變化進行補償，可以計算“有效消光系數"。初始濃度由未發生二聚化的高度稀釋溶液的紫外光譜確定。由于各個吸收在朗伯-比爾定律中表現相加，因此可以使用反應方程或質量作用定律來制定有效消光或有效消光系數。

疏水相互作用
有機染料的聚集尤其發生在水或具有高離子強度的溶劑中。主要原因是分子間范德華力：通過所謂的“疏水相互作用"，親脂性分子試圖“避開"親水性水分子，即為水化殼提供盡可能小的表面積。這種現象還導致玻璃表面上的染料吸附或與基質分子的非特異性結合。

形成二聚體或更高聚集體的傾向取決于
 

由于這是動態平衡（如上所述），因此可以通過稀釋溶液將二聚體轉化回單體。當測量的吸收光譜不再隨著進一步稀釋和層厚度的相應增加而變化時，達到“單體光譜"。對于大多數疏水性ATTO染料，這種情況發生在消光度約為 0.04 時（層厚 1 cm；c = 10 -7 – 10 -6 mol/l）。

蛋白質綴合物中的分子內相互作用/DOL 測定
當染料-NHS 酯與蛋白質的氨基反應時，可以形成染料綴合物，其中共價結合的染料分子非常接近并且可以彼此相互作用。這以同樣的方式通過吸收光譜的強烈變化來表達，正如在 ATTO 565-steptavidin 綴合物的示例中可以清楚地看到的：在綴合物光譜中觀察到額外的短波吸收帶，

類似于濃度足夠高的染料水溶液的“二聚體帶"。由于在這種情況下共價結合的染料分子之間存在分子內相互作用，因此當綴合物溶液稀釋時吸收光譜不會改變！
對于這種情況，染料-蛋白質比率（標記度，DOL）的確定在我們的“蛋白質標記"工作說明中進行了描述。


兩種形式的聚集體之間存在基本區別：

H-聚集體（H = 低色），短波長。
當兩個或多個染料分子以一種其躍遷偶極矩（通常在 S 0 - S 1過渡中彼此平行（沿著發色團系統的縱軸運行）。觀察到向低色位移的吸收帶 - 與單體吸收相反。

由于空間接近，電子結構相互影響，可以說，兩個分子必須一起觀察。能級被分裂，并且量子力學現在允許的吸收躍遷能量更高，因此波長更短。從這種較高的激發態，發生快速內部轉換（IC），從而使熒光猝滅。

J-聚集體（根據 EE Jelley 的說法），長波
這種類型的聚集會導致吸收帶的長波偏移，這與能帶半寬度的顯著減小有關。

J-聚集體通常存在于聚次甲基染料中，例如花青、部花青或類似的發色團。Jelley 和 Scheibe 使用假異花青染料獨立觀察到了這一現象。對于由單個染料組裝形成的“超分子聚合物"的模型描述，已經提出了各種類型。對分子關系簡單的描述是這樣的想法：各個分子一個接一個地排列，使得躍遷偶極矩也位于一條線上。分子的共同考慮導致能級的分裂：量子力學允許的躍遷現在能量較低，

溶劑成分、鹽或其他物質的添加以及濃度會極大地影響聚集。在理想條件下，可以在紫外/可見光譜中找到所描述的極窄吸收帶。此外，與 H 聚集體相比，這里當然可以觀察到熒光，特別是在較低溫度下：發射帶的最大值也很窄，僅比吸收最大值長幾納米。
根據實驗條件，文獻還描述了吸收帶的“加寬"，這可以通過包含 J 聚集體的禁電子躍遷來解釋。

ATTO 488 標記的磷脂
溶液純氯仿中的ATTO 488標記磷脂最初因其意想不到的顏色而令人驚訝：暗淡的溶液呈現粉紅色至洋紅色，而不是帶有亮綠色熒光的淺黃色。長波位移吸收可以通過 J 聚集體的存在來解釋。當所討論的溶液用甲醇稀釋時，顏色變為通常的黃色，并且可以看到強烈的熒光。通過改變溶劑成分，聚集體被推回。
下圖顯示了ATTO 488標記的1,2-二棕櫚酰-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺 (DPPE) 在純氯仿和氯仿/甲醇（8:2，v/v）溶劑混合物中的溶液：