PLA的工作原理

一、鄰位連接技術(shù)（PLA）的工作原理？

 Duolink®鄰位連接技術(shù)(PLA)是一種高特異性、高靈敏地原位檢測內(nèi)源性蛋白、蛋白修飾和蛋白互作的強(qiáng)大工具.該技術(shù)可輕松檢測和定位未改造細(xì)胞和組織內(nèi)單分子級別的蛋白靶標(biāo)。一般先使用不同種屬來源的兩種一抗檢測兩個蛋白靶標(biāo)（圖1A）。接著用一對寡核苷酸標(biāo)記的二抗（PLA探針/鄰位探針）結(jié)合一抗（圖1B）。再加入連接寡核苷酸，當(dāng)一對鄰位探針足夠貼近時，連接寡核苷酸會與鄰位探針對互補(bǔ)雜交，在連接酶的作用下形成封閉的環(huán)狀DNA，作為滾環(huán)擴(kuò)增(RCA)的模板（圖1C）。接著DNA聚合酶以PLA探針為引物，以上述環(huán)狀DNA為模板，通過RCA反應(yīng)合成連環(huán)序列（圖1D）。這使仍與PLA探針相連的序列信號擴(kuò)大1000倍，方便進(jìn)行信號定位。最后，用標(biāo)記寡核苷酸與擴(kuò)增子內(nèi)的互補(bǔ)序列雜交（圖1E），在熒光顯微鏡下表現(xiàn)為散點(diǎn)（PLA信號），實(shí)現(xiàn)可視化和定量分析（圖1F）。Duolink® PLA技術(shù)可結(jié)合免疫熒光（即綠色、紅色、遠(yuǎn)紅或橙色檢測）或免疫組化（即過氧化物酶催化反應(yīng)）檢測貼壁細(xì)胞、細(xì)胞離心涂片和組織切片。此外，Duolink® PLA技術(shù)還可結(jié)合流式細(xì)胞術(shù)檢測血液或懸浮細(xì)胞，也可采用多孔板（例如，96或384孔板）搭配高內(nèi)涵篩選成像儀進(jìn)行高通量分析。Duolink® PLA 的高特異性、靈敏度和多功能性使其成為信號通路分析、藥物篩選、IC50 測定和靶標(biāo)驗(yàn)證的理想選擇。

二、DUOLINK®鄰位連接技術(shù)檢測EGFR和HER2二聚化？

表皮生長因子受體（EGFR，ErbB1，HER1）和人表皮受體2（HER2，ErbB2，Neu）的二聚化是一種蛋白質(zhì)相互作用（PPI）。EGFR和HER2是受體酪氨酸激酶ErbB家族的成員，在細(xì)胞分裂和死亡調(diào)控中起重要作用。影響其中任意一種蛋白質(zhì)的表達(dá)或活性的突變與多種癌癥的發(fā)生發(fā)展有關(guān)。當(dāng)配體（如EGF）結(jié)合EGFR的胞外結(jié)構(gòu)域時，EGFR受體激活并自磷酸化細(xì)胞質(zhì)尾區(qū)。從而與ErbB家族其他成員形成同源(EGFR-EGFR)和異源（例如，EGFR-HER2）二聚體（圖2）。二聚化及之后的磷酸化發(fā)生后，會募集一些銜接蛋白，進(jìn)一步激活幾個胞內(nèi)信號通路，最終可調(diào)節(jié)基因轉(zhuǎn)錄，導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞的增殖、血管生成、侵襲、轉(zhuǎn)移和抗凋亡。