免疫組織化學(xué) (IHC) – 實(shí)驗(yàn)方案

免疫組織化學(xué)是免疫染色在組織學(xué)中的重要應(yīng)用。它需要使用與生物組織中的這些抗原結(jié)合的抗體來特異性檢測(cè)細(xì)胞中的抗原。組織樣本通過石蠟包埋或福爾馬林固定方法固定，并用抗原修復(fù)劑進(jìn)行預(yù)處理。預(yù)處理對(duì)于通過破壞福爾馬林誘導(dǎo)的抗原交聯(lián)來改善抗原的表達(dá)至關(guān)重要。然后封閉載玻片以減少背景，并可以通過直接標(biāo)記或間接測(cè)定進(jìn)行染色。

脫蠟

1. 將載玻片在 60°C 孵育 60 分鐘。

2. 在二甲苯中脫蠟 10 分鐘，然后再重復(fù)一次。

3. 在 100% 酒精中水合 5 分鐘，然后在 95% 酒精中水合 5 分鐘，然后在 85% 酒精中水合 5 分鐘，然后在 75% 酒精中水合 5 分鐘。

4. 浸入蒸餾水中5分鐘

5. 浸入 TBS（50 mM Tris、100 mM NaCl、pH 7.6）中，放置 5 分鐘，然后重復(fù)兩次。

抗原修復(fù)

1. 將 500-2000 ml 10 mM 檸檬酸鹽緩沖液 (pH6.0) 在不銹鋼高壓鍋中煮沸。

2. 將載玻片放入染色架中，然后放入高壓鍋中，確保載玻片充分浸入檸檬酸鹽緩沖液中。

3. 3-4 分鐘后，當(dāng)壓力指示閥上升時(shí)，孵育 1 分鐘。

4. 將載玻片自然冷卻至室溫。

5. 浸入蒸餾水中，放置 5 分鐘，重復(fù)兩次。

6. 將載玻片浸入 TBS 中 5 分鐘，然后重復(fù)兩次。

7. 在室溫下將載玻片浸入 3% H2O2（新鮮甲醇中）15 分鐘。

8. 用蒸餾水清洗兩次，每次5分鐘。

9. 用TBS（pH 7.6）洗滌兩次，每次5分鐘。

一抗染色

1. 用 TBS 中的 3% BSA 稀釋一抗。用稀釋的一抗覆蓋載玻片上的組織切片（每張載玻片使用 50-150 μl）。

2. 37℃孵育30分鐘或室溫60分鐘（最佳孵育時(shí)間、孵育溫度和抗體稀釋度應(yīng)由各個(gè)實(shí)驗(yàn)室確定）。

3. 用TBS洗滌兩次，每次5分鐘。

二抗染色

1. 與 100-200μl 聚合物增強(qiáng)劑一起孵育 37C 孵育 30 分鐘

2. 用TBS洗滌3次，每次5分鐘。

3. 與 100 200μl 聚合 HRP 一起孵育，并在 37C 下孵育 30 分鐘

4. 用TBS洗滌3次，每次5分鐘。

5. 加入dAb溶液，孵育3-10分鐘（反應(yīng)進(jìn)度和最佳時(shí)間應(yīng)根據(jù)顯微鏡確定）。

6. 用蒸餾水清洗2次，每次5分鐘。

7. 如果需要，用蘇木精復(fù)染切片，用蒸餾水清洗。將玻片浸入 0.1% HCl 乙醇中 1-10 秒，用蒸餾水清洗。

8. 95%乙醇脫水1分鐘，100%乙醇脫水2×3分鐘，二甲苯脫水2×3分鐘，蓋玻片封固劑。