蛋白質(zhì)和其他硫醇化生物分子的馬來(lái)酰亞胺標(biāo)記

硫醇與馬來(lái)酰亞胺的反應(yīng)是廣泛用于生物共軛和標(biāo)記生物分子（包括蛋白質(zhì)和肽）的過(guò)程。它按照以下方案進(jìn)行：

馬來(lái)酰亞胺是對(duì)硫醇表現(xiàn)出高選擇性的親電子化合物。雖然馬來(lái)酰亞胺在自然界中幾乎不存在，但硫醇卻非常豐富。它們以半胱氨酸殘基形式存在于蛋白質(zhì)和肽中。盡管天然DNA不含硫醇，但具有硫醇基團(tuán)的合成寡核苷酸可以很容易地制備。

硫醇易于氧化二聚并形成二硫鍵。因此，半胱氨酸殘基形成二硫鍵，從而穩(wěn)定蛋白質(zhì)的三級(jí)結(jié)構(gòu)。二硫化物不與馬來(lái)酰亞胺反應(yīng)。因此，有必要在綴合前還原二硫化物并排除反應(yīng)中的氧氣。

綴合方案取決于起始組分的溶解度。對(duì)于水溶性較低的化合物（如大多數(shù)熒光染料馬來(lái)酰亞胺），必須使用有機(jī)共溶劑（如 DMSO或 DMF）。

我們建議采用以下方案將Lumprobe 染料馬來(lái)酰亞胺與蛋白質(zhì)、肽和其他硫醇化生物分子結(jié)合。

1. 將待標(biāo)記的蛋白質(zhì)或其他含有硫醇的分子溶解在塑料小瓶中的脫氣緩沖液中，pH 7-7.5（PBS、Tris 和 HEPES 很好，但也可以使用其他不含硫醇的緩沖液）?？梢酝ㄟ^(guò)在緩沖液上施加真空幾分鐘或通過(guò)惰性氣體（氮?dú)狻鍤饣蚝猓┕呐輥?lái)對(duì)緩沖液進(jìn)行脫氣。對(duì)于蛋白質(zhì)，最佳濃度為 1-10 mg/mL。

2. 添加過(guò)量的 TCEP（三羧乙基膦）試劑以減少二硫鍵，用惰性氣體沖洗并關(guān)閉。 TCEP 過(guò)量 100 倍就可以了。將混合物在室溫下放置 20 分鐘。

3. 將馬來(lái)酰亞胺染料溶解在 DMSO 或新鮮 DMF 中（100 uL 中 1-10 mg）。

4. 將馬來(lái)酰亞胺染料溶液添加到硫醇溶液中（染料過(guò)量 20 倍），用惰性氣體沖洗小瓶，然后緊緊關(guān)閉。

5. 充分混合并在 4°C 或室溫下放置過(guò)夜。

6. 通過(guò)凝膠過(guò)濾、HPLC、FPLC 或電泳純化產(chǎn)物。

對(duì)于水溶性差的馬來(lái)酰亞胺，像大多數(shù)染料馬來(lái)酰亞胺一樣，我們建議使用共溶劑（DMF 或 DMSO）。具有良好水溶性的馬來(lái)酰亞胺（如磺基-氰基馬來(lái)酰亞胺）可以溶解在水中。如果出現(xiàn)沉淀，請(qǐng)?jiān)黾踊旌衔镏杏袡C(jī)助溶劑的含量，以實(shí)現(xiàn)更好的標(biāo)記。

建議僅將透析作為純化具有良好水溶性的馬來(lái)酰亞胺的方法。