使用 3Dye 差異蛋白質組試劑進行蛋白質標記

差異蛋白質組學可以比較來自不同生物來源的大量蛋白質。通常的例子是經過處理和未經處理的細胞、不同的細菌菌株。即使蛋白質譜中的微小差異也可以通過差異蛋白質組學來發現。

Lumiprobe 3Dye 套件包含 Cyanine2、Cyanine3 和 Cyanine5 染料，它們的光譜不同，但遷移率匹配。因此，用這些染料標記的蛋白質在凝膠電泳中共同遷移。由于使用染料進行的蛋白質標記依賴于 NHS 酯化學，因此賴氨酸殘基是標記的主要位點。

二維蛋白質組學的最佳實踐意味著使用合并的內部對照樣本，該樣本本質上是在一個實驗中分析的兩個樣本的混合物。內部對照樣品用 Cyanine2 標記，分析樣品用 Cyanine3 或 Cyanine5 標記（這兩種染料可以互換）。

3Dye 試劑以 5 nmol、10 nmol 和 25 nmol 包裝進行預先測量。染料被凍干以延長其保質期。每個包裝在使用前均應用 DMF 重新配制。 DMF 質量對于實驗和產品保質期至關重要。套件中的染料附帶 DMF。

蛋白質混合物的制備是測定中變化最大、要求最高的部分。它超出了協議的范圍，因為不同的樣品需要非常不同的裂解條件才能獲得適合檢測的蛋白質混合物。本質上，被比較的兩個樣品應該在相同的條件下裂解以獲得有意義的結果。一般來說，如果實驗需要裂解，建議使用基于 CHAPS 的裂解溶液。

在比較兩種蛋白質混合物的制備后，可以使用以下方案來實現標記：

1. 通過每 1 nmol 每種染料添加 1 μL DMF（來自試劑盒），制備每種染料的 1 mM 庫存溶液。這些溶液在 -20°C 下可穩定保存三個月。為了確保保質期，在打開前將管干燥、全解凍，在關閉前盡可能用惰性氣體吹掃。

2. 使用無胺緩沖液（NaHCO3、醋酸鹽）或 Tris 緩沖液將蛋白質混合物 pH 調節至 8.5。在單獨的小瓶中，準備三個用于標記的蛋白質樣品：(1) 第一個蛋白質樣品，(2) 第二個蛋白質樣品，以及 (3) 兩者的混合物（合并的內部對照）。每個樣品中的蛋白質濃度理想情況下應為 5–10 mg/mL，但也可以使用低至 1 mg/mL 的濃度。每次反應取 50 μg 蛋白質。

3. 通過取等分的 1 mM 庫存溶液并用 DMF 稀釋至 0.4 mM 來制備染料工作溶液。

4. 將 1 μL 工作染料溶液添加到反應混合物中：Cyanine3 表示未處理，Cyanine5 表示處理過（反之亦然），Cyanine2 表示合并的內部對照。通過移入和移出混合每個反應，并在黑暗中放置 30 分鐘。

5. 通過向每種溶液中添加 1 μL 10 mM 賴氨酸來停止反應（試劑盒中不包含該試劑，但該試劑很容易獲得）。

6. 合并三個樣品并運行 2D 凝膠。

7. 使用任何能夠檢測 Cyanine2、Cyanine3 和 Cyanine5 的成像儀進行分析。可以從凝膠上切下蛋白質斑點并通過質譜分析。