如何為成功檢測選擇合適的抗體

抗體是生物化學(xué)、細胞生物學(xué)和免疫學(xué)實驗室的重要檢測工具。鑒于用于無數(shù)應(yīng)用的抗體和抗體片段種類繁多，有時找到合適的抗體和抗體片段是一項艱巨的任務(wù)，更不用說可能危及抗體依賴性實驗的廣泛問題。交叉反應(yīng)性、批次間差異以及在未經(jīng)測試的應(yīng)用中使用抗體等常見原因被認為是導(dǎo)致結(jié)果不一致的原因。在這里，我們分享了一些實驗室到實驗室的技巧，以選擇您研究目的的抗體。

定義您的蛋白質(zhì)靶標(biāo) – 了解蛋白質(zhì)靶標(biāo)的生物學(xué)特性，因為蛋白質(zhì)靶標(biāo)可能非常復(fù)雜，并且與相關(guān)蛋白質(zhì)的序列同一性或同源性可能會產(chǎn)生潛在的交叉反應(yīng)性。使用 GeneCards 等數(shù)據(jù)庫來識別抗原的命名法和任何替代名稱，并使用 UniProt 獲得目標(biāo)蛋白質(zhì)的氨基酸序列。

選擇正確的應(yīng)用程序 – 選擇與您的研究最匹配的應(yīng)用程序。這取決于您需要回答研究問題的數(shù)據(jù)類型。例如，Western blot 是研究蛋白質(zhì)濃度的應(yīng)用;免疫組織化學(xué)和免疫細胞化學(xué)用于研究定位，因為它們與固定的細胞和組織一起工作;而 ELISA、FACS 和流式細胞術(shù)是研究蛋白質(zhì)相互作用和表達的合適技術(shù)。

確保抗體適合您的樣品 – 由于靶標(biāo)的序列和結(jié)構(gòu)因物種而異，因此請使用已針對您感興趣的物種專門驗證的抗體。在這種情況下，請相信數(shù)據(jù)表：如果抗體已針對一種物種進行了驗證，則無法保證它對其他物種有效。

選擇兼容的抗體 – 不應(yīng)假設(shè)已證明可在一種應(yīng)用中檢測靶標(biāo)的抗體在其他應(yīng)用中也能檢測到靶標(biāo)。免疫化學(xué)應(yīng)用依賴于使用敏感和高度特異性的抗體。更具體地說，它們?nèi)Q于抗原識別靶蛋白的能力。為了實現(xiàn)有效的抗原-抗體相互作用，表位必須易于結(jié)合。有時抗原可能需要靶蛋白以天然和折疊形式存在，或以變性形式存在。

通過固定、pH 值變化或在凝膠電泳制備過程中，表位可能會發(fā)生變化，這可能會影響其與抗體相互作用的能力。例如，在 IHC 研究中，抗體可以識別冰凍組織切片中的表位，但該表位可能無法在已變性以進行 Western 印跡分析的樣品中獲得。

選擇宿主物種 – 通常，建議避免使用與目標(biāo)樣品物種相同的宿主抗體物種，以避免干擾免疫球蛋白。選擇宿主物種時，請考慮針對一抗的宿主物種產(chǎn)生的二抗，并根據(jù)應(yīng)用進行選擇。

研究產(chǎn)品數(shù)據(jù)表并準(zhǔn)備好優(yōu)化您的方案 – 產(chǎn)品數(shù)據(jù)表通常包含許多重要細節(jié)，包括免疫原的描述、表位的性質(zhì)、宿主物種、交叉反應(yīng)性和推薦的起始稀釋度。因此，在設(shè)置方案時需要考慮許多因素，例如封閉緩沖液、抗體稀釋劑、孵育步驟的長度和檢測方法。所有這些額外的細節(jié)將幫助您優(yōu)化實驗方案以實現(xiàn)成功的分析。

始終包括實驗對照 – 在規(guī)劃實驗時，對照是有助于了解結(jié)果是成功還是失敗的關(guān)鍵部分。大多數(shù)常見的實驗技術(shù)需要特定的控制來幫助解釋數(shù)據(jù)。例如，Western 印跡應(yīng)始終包含上樣對照，而 IHC 和 IF 應(yīng)始終具有多個陰性對照，以幫助區(qū)分信號與背景噪音。

陽性對照的示例可能包括重組蛋白或由已知可產(chǎn)生可檢測靶標(biāo)水平的細胞系制備的裂解物;而陰性對照可能包括使用敲除樣品或省略一抗，這兩者都可以檢測到二抗引起的背景染色。

總之，盡管找到適用于特定應(yīng)用的抗體有時仍然是一項艱巨的任務(wù)，但我們希望這些提示和指南能為您的搜索提供一些有用的起點。