使用 PROTRAP 進行自上而下的樣品制備

準備注意事項
ProTrap XG 設備經(jīng)過優(yōu)化，可處理 50 μg 蛋白質。
對于可重現(xiàn)和最大的蛋白質沉淀，沉淀過程中樣品中的最大SDS含量應為1%。如果您的提取或裂解緩沖液含有超過 1% SDS，請使用最大離子強度為 300 mM 的緩沖液稀釋。
離心速度基于帶 24 x 1.5/2.0 mL 轉子的標準臺式微量離心機。
提供的時間僅供參考。
如果過濾濾芯中殘留的液體超過幾微升，請將其返回到離心機并重復旋轉，或考慮提高旋轉速度。建議在后續(xù)旋轉中使用 3000 ×g （6000 rpm），ProTrap XG 已經(jīng)過高達 9000 ×g （10，000 rpm） 的測試。

所需材料
所有化學品和試劑應為ACS級/HPLC級或更高。
丙酮
5 M 氯化鈉水溶液
80%甲酸水溶液（冷卻至–20°C）
冷凍水

自上而下的樣品制備方案

對于可重現(xiàn)和最大的蛋白質沉淀，沉淀過程中樣品中的最大SDS含量應為1%。如果您的提取或裂解緩沖液含有超過 1% SDS，請使用最大離子強度為 300 mM 的緩沖液稀釋。 為獲得最佳體驗，樣品應至少含有 50 mM NaCl。 如果需要添加氯化鈉，請使用 5 M 氯化鈉溶液。

• 不要讓過濾濾芯中的膜在步驟之間變干。

• 將塞子擰到濾芯的底座上。 

• 將 100 μL 稀釋的樣品蛋白轉移到堵塞的過濾柱中。

• 加入 400 μL 室溫丙酮。

• 蓋上過濾濾芯并輕輕搖晃，傾斜不超過 45°，以混合溶劑。 

• 將過濾柱插入微量離心管中，等待 30 分鐘，使蛋白質在室溫下聚集。

• 連接塞子后，以 2500 × g （5000 rpm） 離心×2 分鐘。

• 從微量離心管中取出過濾盒，倒置并擰下塞子。

• 將帶蓋的過濾柱放回微量離心管中，并以 500 × （2000 rpm） 離心×3 分鐘。 丟棄通過溶劑的流量。 如果過濾濾芯中殘留任何溶劑，請以 3000 ×g （6000 rpm） 的速度重新旋轉裝置 2-5 分鐘。

• 用 400 μL 丙酮清洗蛋白質顆粒。立即以 500 × g (2000 rpm) × 2 分鐘離心。丟棄流過洗滌溶劑的流。

• 更換插頭。在 –20°C 下將過濾筒中的沉淀物冷卻 10 分鐘。

• 在水中加入 50 µL 冷 (-20°C) 80% 甲酸。蓋上濾芯，放入冰箱 10 分鐘，然后超聲處理 1 分鐘。

• 加入 450 µL 冷凍水；蓋并渦旋以混合溶劑。

• 完整的蛋白質可以在干凈的微量離心管中直接回收，以 350 × g (2000 rpm) × 5 分鐘的速度離心。

如果需要進一步的蛋白質凈化，再溶解的蛋白質也可以使用提供的可選 SPE 小柱和 SPE蛋白質/肽凈化方案進行 SPE 。